Kiểm tra Bacillus Subtilis trong các chế phẩm vi sinh vật thức ăn chăn nuôi

ICS 65.120                                                                                                                  CLassification số: B 46

GB / T 26428-2010

PTiêu chuẩn quốc gia của Cộng hòa Trung Hoa nhân dân

Tiêu chuẩn kiểm tra Bacillus Subtilis trong thức ăn chăn nuôi

Ngày phát hành: 2011-01-14                                                                                  

Thực hiện: 2011-07-01 

Cấp bởi:PTổng cục Giám sát, Kiểm tra và Kiểm dịch chất lượng của Cộng hòa Trung Hoa & Ủy ban Quản lý Tiêu chuẩn hóa Quốc gia Trung Quốc

Lời tựa

Tiêu chuẩn này được soạn thảo theo các quy định của GB / T 1.1-2009.

Tiêu chuẩn này thuộc thẩm quyền của Ủy ban kỹ thuật tiêu chuẩn hóa ngành thức ăn chăn nuôi quốc gia (SAC / TC 76).

Tiêu chuẩn này được đề xuất và soạn thảo bởi: Trung tâm phân tích và kiểm nghiệm vi sinh của tỉnh Quảng Đông.

Những người soạn thảo tiêu chuẩn này chính là: Honghui Zhu, Xiaotang Sun, Songzhen Yang, Yuanliang Chen, và Xianjiao Zhang.

Kiểm tra Bacillus Subtilis trong các chế phẩm vi sinh vật thức ăn chăn nuôi

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này xác định các quy định đối với việc thử nghiệm bacillus subtilis trong chế phẩm vi sinh vật thức ăn chăn nuôi.

Tiêu chuẩn này có thể áp dụng để thử nghiệm và tính toán vi khuẩn bacillus subtilis trong chế phẩm vi sinh vật thức ăn chăn nuôi.

2. Tài liệu tham khảo quy chuẩn

Các tài liệu sau đây là cần thiết cho việc áp dụng tài liệu này. Đối với tài liệu tham khảo ngày tháng, chỉ phiên bản ghi ngày tháng mới áp dụng cho tài liệu này. Đối với các tài liệu được trích dẫn không ghi ngày tháng, phiên bản mới nhất (bao gồm tất cả các sửa đổi) được áp dụng cho tài liệu này:

GB / T 8170 Quy tắc làm tròn số, và biểu thức & đánh giá các giá trị giới hạn

GB / T 14699.1 Lấy mẫu nguồn cấp dữ liệu (GB / T 14699.1 - 2005, ISO 6497: 2002, IDT)

GB / T 20195 Thức ăn chăn nuôi: Chuẩn bị mẫu (GB / T 20195 - 2006, ISO 6498: 1998, IDT)

3. Chất pha loãng, Phương tiện và Thuốc thử

Trừ khi có quy định khác, chỉ các thuốc thử tinh khiết phân tích và nước cất hoặc khử ion hoặc nước tinh khiết tương đương mới được sử dụng trong phân tích.

3.1.  0,85% muối tiệt trùng

3.2.  Môi trường thạch dinh dưỡng (NA), xem A.1 của Phụ lục A

3.3.  Dung dịch nhuộm Gram, xem A.2 của Phụ lục A

3.4.  Môi trường tăng trưởng natri clorua 7%, xem A.3 của Phụ lục A

3.5.  Thử nghiệm VP đối với môi trường và thuốc thử, xem A.4 của Phụ lục A

3.6.  Môi trường khử nitrat và thuốc thử, xem A.5 của Phụ lục A

3.7.  Môi trường lên men D-mannitol, xem A.6 của Phụ lục A

3.8.  Môi trường sử dụng propionat, xem A.7 của Phụ lục A

4. Thiết bị và Dụng cụ thủy tinh

Ngoài các thiết bị thí nghiệm thường dùng trong vi sinh, các thiết bị và dụng cụ thủy tinh khác được liệt kê như sau:

4.1.  Tủ ấm điều nhiệt: 37 ºC ± 1 ºC

4.2.  Máy đo pH, chính xác đến ± 0,1 đơn vị

4.3.  Đĩa petri thủy tinh hoặc nhựa

4.4.  Pipet chia tỷ lệ có dung tích đánh dấu 1 ml và 10 ml, với thang chia nhỏ nhất tương ứng là 0,1 ml và 0,5 ml

4.5.  Thanh thủy tinh hoặc bọc nhựa

4.6.  Kính hiển vi, với khả năng thu phóng 1000 lần

5. Lấy mẫu

Các mẫu thử là thật và mang tính đại diện. Các dụng cụ lấy mẫu như xẻng, thìa lấy mẫu, ống nghiệm, lọ, kéo, ... cần được tiệt trùng.

Cần gửi mẫu đến phòng xét nghiệm vi sinh càng sớm càng tốt. Kích thước và phương pháp lấy mẫu phải được thực hiện theo GB / T 14699.1.

6. Chuẩn bị mẫu

Việc chuẩn bị mẫu phải được thực hiện theo GB / T 20195 và mẫu phải được kiểm tra càng sớm càng tốt sau khi chuẩn bị.

7. Quy trình hoạt động

7.1. Chuẩn bị mẫu để kiểm tra & đình chỉ ban đầu và pha loãng 10 lần.

Sử dụng các thao tác và điều kiện vô trùng, cân 25 g (ml) mẫu, thêm 225 ml nước muối sinh lý đã khử trùng 0,85%, đồng nhất trong 1-2 phút và tạo huyền phù ban đầu 1:10. Sau đó, hút 1 ml huyền phù ban đầu tỷ lệ 1:10, thêm 9 ml nước muối sinh lý tiệt trùng 0,85% và trộn kỹ để tạo thành độ pha loãng 1: 100. Theo hàm lượng vi khuẩn của mẫu, tiếp tục thực hiện độ pha loãng tăng dần lên mười lần.

7.2.  Cấy và nuôi cấy

Chọn 2-3 độ pha loãng thích hợp, giữ và duy trì trong 10 phút trong nồi cách thủy ở 80 ºC ± 1 ºC, hút 0,1 ml bằng pipet vô trùng và cấy vào hai đĩa thạch dinh dưỡng (3.2). Dùng que phủ để bôi chất cấy lên bề mặt thạch một cách cẩn thận và nhanh chóng nhất có thể. Que phủ không được chạm vào mép của đĩa petri. Dùng que phủ vô trùng cho từng đĩa. Đậy đĩa petri đã tráng và để yên ở nhiệt độ phòng trong 15 phút để chất cấy được hấp thụ hoàn toàn bởi thạch. Lật ngược đĩa và đặt trong tủ ấm ở 37 ºC ± 1 ºC trong 48 ± 2 h.

7.3. Đếm và Sàng lọc khuẩn lạc

Sau khi ủ, chọn đĩa có số khuẩn lạc từ 30-300. Nếu các khuẩn lạc hình vảy lớn mọc trong đĩa thì nó không được công bố là sử dụng. Tuy nhiên, nếu các khuẩn lạc hình vảy nhỏ hơn một nửa đĩa và sự phân bố của các khuẩn lạc trong nửa đĩa còn lại là rất đồng đều, bạn có thể tính một nửa số khuẩn lạc trong đĩa và nhân kết quả với 2 để biểu thị tổng số khuẩn lạc của đĩa. Khuẩn lạc của Bacillus Subtilis điển hình thô ráp, mờ đục, không sáng, với các cạnh giãn ra, hình tròn hoặc gợn sóng, hình dạng bất thường và có màu trắng xám hoặc hơi vàng. Cuối cùng, chọn 5 khuẩn lạc có các đặc điểm này để xác nhận thí nghiệm.

7.4. Kiểm tra xác nhận

7.4.1. Tổng quat

Hiện tại, nếu môi trường nuôi cấy được sử dụng trong bộ dụng cụ nhận dạng sinh hóa thương mại hoặc ống nhận dạng sinh hóa giống với môi trường được sử dụng trong phép thử xác nhận của tiêu chuẩn này, thì bộ dụng cụ hoặc ống này có thể được sử dụng theo hướng dẫn hàng hóa để thực hiện xác nhận này. thử nghiệm.

7.4.2. Chuẩn bị căng thẳng

Chọn một khuẩn lạc đơn lẻ từ đĩa petri và cấy que cấy lên đĩa thạch dinh dưỡng và nuôi cấy ở 37 ºC ± 1 ºC, trong 48 ± 2 h. Ít nhất một khuẩn lạc đặc trưng được phân lập tốt phải được lấy từ mỗi đĩa, vạch và chuyển lên đĩa thạch, và lưu trữ để kiểm tra xác nhận.

7.4.3. Quan sát hình thái học

Các khuẩn lạc tinh sạch đã chọn được kiểm tra qua kính hiển vi Nhuộm Gram (3.3). Tế bào Bacillus Subtilis phải có hình que, với các bào tử có hình bầu dục, ở Đại Trung sinh hoặc gần Trung sinh, và các nang không được mở rộng đến mức đáng kể.

7.4.4. Kiểm tra xác nhận hóa lý

Các khuẩn lạc tinh khiết được chọn để thử nghiệm: tăng trưởng natri clorua 7% (3.4), thử nghiệm VP (3.5), khử nitrat (3.6), lên men D-mannitol (3.7) và sử dụng propionat (3.8).

7.4.5. Xác nhận kết quả

Xác nhận kết quả được liệt kê dưới đây:

1. Khuẩn lạc Bacillus Subtilis có bề mặt thô ráp, màu trắng đục, màu trắng xám hoặc hơi vàng, là hình que với các bào tử hình bầu dục, Mesozoi hoặc gần Mesozoi, với các nang không to lên đáng kể.

2. Kết quả xét nghiệm dương tính với chất tăng trưởng natri clorua 7%, xét nghiệm VP, và khử nitrat.

3. Axit có thể được tạo ra thông qua quá trình lên men D-mannitol.

4. Nó có thể được đánh giá và xác định là Bacillus Subtilis mà không sử dụng propionat.

Các đặc điểm phân biệt của Bacillus Subtilis và các vi khuẩn giống Bacillus được trình bày trong Bảng 1 dưới đây.

Bảng 1. Đặc điểm phân biệt của vi khuẩn Bacillus Subtilis và vi khuẩn giống Bacillus

số 8. Tính toán kết quả và báo cáo

8.1.  Tính số lượng khuẩn lạc Bacillus Subtilis trên mỗi món ăn.

Tính số lượng khuẩn lạc Bacillus Subtilis (một) trên mỗi món ăn theo Công thức 1:

Công thưc 1

a =(b ÷ A) x C

Huyền thoại:

một:Số lượng khuẩn lạc Bacillus Subtilis trên mỗi đĩa;

b:Số khuẩn lạc được xác nhận là khuẩn lạc Bacillus Subtilis sau khi chọn mẫu;

MỘT:Số khuẩn lạc được chọn để xác nhận (5);

C:Số khuẩn lạc trên đĩa thể hiện các đặc điểm phân biệt của Bacillus subtilis

Kết quả cuối cùng (một) phải được làm tròn đến số nguyên gần nhất theo quy tắc làm tròn số trong GB / T 8170.

Ví dụ:

Nếu có tổng số 78 khuẩn lạc trên đĩa có các đặc điểm của Bacillus Subtilis, 5 khuẩn lạc được chọn để kiểm tra xác nhận và 4 khuẩn lạc trong số đó được xác nhận là khuẩn lạc Bacillus Subtilis, thì:

một= (4/5) x 78 = 62,4

một= 62,4 ~ 62

Theo quy tắc làm tròn số trong GB / T 8170, số lượng khuẩn lạc Bacillus Subtilis (một) trên món ăn này là 62.

8.2.  Số lượng khuẩn lạc Bacillus Subtilis trong mẫu: Phương pháp tính toán & báo cáo

Chọn 2 đĩa pha loãng nối tiếp (mỗi độ pha loãng phải có ít nhất một đĩa, với số lượng Bacillus Subtilis được xác nhận trong khoảng 30 - 300 trên đĩa.), Tính theo Công thức 2, là 1 ml hoặc 1 g Bacillus Subtilis trong mẫu. , N.

Công thức 2

N = Ʃmột / V (n₁ + 0,1n₂) · D

Huyền thoại:

N:Tổng số Bacillus Subtilis trong mẫu;

Ʃmột:Tổng số Bacillus Subtilis được xác nhận trên tất cả các món ăn;

TRONG:Thể tích cấy vào đĩa, ml;

N₁:Số đĩa của dung dịch pha loãng đầu tiên;

N₂:Số đĩa cho độ pha loãng thứ hai;

d:Hệ số pha loãng của dung dịch pha loãng đầu tiên (giá trị củadđối với mẫu không pha loãng là 1).

Kết quả cuối cùng (N) phải được làm tròn đến 2 chữ số có nghĩa gần nhất theo quy tắc làm tròn số trong GB / T 8170. Số lượng khuẩn lạc Bacillus Subtilis trong mẫu cũng có thể được ghi lại bằng cách sử dụng Ký hiệu Khoa học (1,0 - 9,9 lần 10^x).

Báo cáo số lượng Bacillus Subtilis ước tính trên mỗi ml hoặc g mẫu, CFU / g hoặc CFU / ml.

Ví dụ 1:

Nếu sau lần pha loãng đầu tiên (10^-3), số khuẩn lạc Bacillus Subtilis được xác nhận lần lượt là 168 và 215, và sau khi pha loãng thứ hai (10^-4), số lượng khuẩn lạc Bacillus Subtilis được xác nhận lần lượt là 34 và 35, khi đó:

N = (168 + 215 + 34 + 35) / [0,1 x (2 + 0,1 · 2) x 10^-3]

N = 472 / 0,00022

N = 2145450 ~ 2100000

Theo quy tắc làm tròn số trong GB / T 8170, số lượng Bacillus Subtilis ước tính của mẫu trong ví dụ này tính bằng đơn vị g hoặc ml, là 2100000 CFU / g (hoặc ml), hoặc 2,1 x 10⁶ CFU / g (hoặc ml).

Ví dụ 2:

Nếu độ pha loãng cuối cùng (10^-4) xác nhận rằng số lượng khuẩn lạc Bacillus Subtilis tương ứng là 120 và 130, khi đó:

N = (120 + 130) / (0,1 x 2 x 10^-4)

N = 250 / 0,00002

N = 12500000 ~ 12000000

Theo quy tắc làm tròn số trong GB / T 8170, số lượng Bacillus Subtilis ước tính của mẫu trong ví dụ này tính bằng đơn vị g hoặc ml, là 12000000 CFU / g (hoặc ml), hoặc 1,2 x 10⁷ CFU / g (hoặc ml).